近日，精密測(cè)量院楊俊研究團(tuán)隊(duì)在天然細(xì)胞膜固體核磁共振（NMR）結(jié)構(gòu)測(cè)定方面取得系列進(jìn)展，相關(guān)研究成果發(fā)表在國(guó)際期刊《科學(xué)-進(jìn)展》（Science Advances）和《美國(guó)化學(xué)會(huì)志-金》（JACS Au）上。

研究團(tuán)隊(duì)在膜蛋白細(xì)胞膜樣品制備和原位結(jié)構(gòu)測(cè)定方面取得進(jìn)展

膜蛋白在高度異質(zhì)和復(fù)雜的細(xì)胞膜環(huán)境中行使功能。細(xì)胞膜的組成以及物理化學(xué)性質(zhì)對(duì)膜蛋白的結(jié)構(gòu)和功能有重要的影響，因此準(zhǔn)確地闡明膜蛋白在天然細(xì)胞膜環(huán)境中的結(jié)構(gòu)對(duì)于理解其真實(shí)的功能機(jī)制至關(guān)重要。但是在天然細(xì)胞膜中測(cè)定膜蛋白的結(jié)構(gòu)面臨著諸多挑戰(zhàn)，這主要是因?yàn)樘烊患?xì)胞膜系統(tǒng)的高度不均勻性、復(fù)雜的背景信號(hào)干擾以及目標(biāo)蛋白的低豐度限制了常用結(jié)構(gòu)分析技術(shù)的檢測(cè)分辨率和靈敏度。因此迄今為止，蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中幾乎所有可用的膜蛋白結(jié)構(gòu)均是在體外簡(jiǎn)化的膜模擬物（如去垢劑膠束、 納米盤和合成磷脂膜等）中得到（圖2）。然而，這些膜模擬環(huán)境均很難模擬出天然細(xì)胞膜獨(dú)特的理化特性，如細(xì)胞膜的疏水厚度、側(cè)壓、化學(xué)梯度、電場(chǎng)梯度等，這些理化特性的差異可能會(huì)對(duì)膜蛋白的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生影響。此外，在這些樣品制備過程中需要將膜蛋白從其原生的細(xì)胞膜環(huán)境中提取出來，再重組到膜模擬環(huán)境中，這可能會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)改變或活性喪失。因此，在天然的細(xì)胞膜環(huán)境中測(cè)定膜蛋白結(jié)構(gòu)是一個(gè)非常重要但極具挑戰(zhàn)性的課題。

不同膜模擬環(huán)境

固體NMR在膜蛋白原位結(jié)構(gòu)測(cè)定方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，但同樣也面臨著背景信號(hào)干擾嚴(yán)重、目標(biāo)信號(hào)信噪比弱、難以獲得足夠數(shù)量距離約束等嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。雖然前人已經(jīng)進(jìn)行了諸多嘗試，但迄今為止，還未能成功在天然細(xì)胞膜中測(cè)定膜蛋白高分辨率三維結(jié)構(gòu)。為了克服這些困難，楊俊研究團(tuán)隊(duì)提出了一種新的固體NMR結(jié)構(gòu)測(cè)定方法，該方法包括改進(jìn)的細(xì)胞膜樣品制備方案、先進(jìn)的固體NMR技術(shù)和結(jié)構(gòu)模型輔助的歸屬策略，成功在天然細(xì)胞膜中實(shí)現(xiàn)了膜蛋白三維結(jié)構(gòu)的測(cè)定。

背景蛋白信號(hào)的干擾一直是利用固體NMR測(cè)定天然細(xì)胞膜中膜蛋白三維結(jié)構(gòu)的一個(gè)主要障礙。研究團(tuán)隊(duì)結(jié)合各種抑制背景蛋白表達(dá)和標(biāo)記的技術(shù)，包括優(yōu)化蛋白表達(dá)條件、菌株篩選、“雙培養(yǎng)基”以及內(nèi)外膜分離等，提出了一種改進(jìn)的樣品制備方案（圖3）。該方案可以實(shí)現(xiàn)背景蛋白信號(hào)的完全抑制，同時(shí)保持目標(biāo)蛋白的高靈敏度。

改進(jìn)的細(xì)胞膜樣品制備方案

基于所建立的天然細(xì)胞膜樣品制備方案，研究團(tuán)隊(duì)在天然細(xì)胞膜中成功表征了機(jī)械敏感性通道蛋白MscL的二級(jí)結(jié)構(gòu)，并證明了獲取其長(zhǎng)程距離約束的可行性。這一突破為進(jìn)一步在天然細(xì)胞膜中測(cè)定膜蛋白的三維結(jié)構(gòu)奠定了基礎(chǔ)。

為了獲得足夠數(shù)量的距離約束，研究團(tuán)隊(duì)采用先進(jìn)的固體NMR技術(shù)，包括多種¹³C-¹³C偶極重耦方法（圖4A），而后引入了結(jié)構(gòu)模型輔助的歸屬策略，通過利用單體和四聚體結(jié)構(gòu)模型來減少距離約束的模糊性（圖4B)， 最終獲得了1000多個(gè)距離約束。

高質(zhì)量歸屬和距離約束譜圖和結(jié)構(gòu)模型輔助的歸屬策略

基于上述結(jié)構(gòu)測(cè)定方法，研究團(tuán)隊(duì)成功地在天然細(xì)胞膜中測(cè)定了水通道蛋白AqpZ的結(jié)構(gòu)，其骨架均方根偏差（RMSD）為1.7 0.4 ？。這是國(guó)際上首次利用固體NMR在天然細(xì)胞膜中實(shí)現(xiàn)膜蛋白高分辨率三維結(jié)構(gòu)的測(cè)定。這項(xiàng)研究證明了固體NMR在天然細(xì)胞膜環(huán)境中測(cè)定膜蛋白高分辨率三維結(jié)構(gòu)的可行性和巨大潛力，對(duì)于結(jié)構(gòu)生物學(xué)領(lǐng)域具有重要意義。

結(jié)構(gòu)測(cè)定方法以“Solid-state NMR structure determination of a membrane protein in E. coli cellular inner membrane”為題發(fā)表在國(guó)際期刊《科學(xué)-進(jìn)展》（Science Advances）上，精密測(cè)量院博士后謝華勇、趙永祥為第一作者，楊俊為通訊作者。細(xì)胞膜樣品制備方法以“Membrane Protein Structures in Native Cellular Membranes Revealed by Solid-state NMR Spectroscopy”為題發(fā)表在《美國(guó)化學(xué)會(huì)志-金》（JACS Au）上，精密測(cè)量院博士后張艷、博士生甘悅芳、實(shí)驗(yàn)師趙偉靜為第一作者，謝華勇、楊俊為通訊作者。精密測(cè)量院為以上研究工作的第一完成單位，以上研究工作得到了科技部重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃和國(guó)家自然科學(xué)基金的資助。

論文鏈接：

Science Advances : https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.adh4168

JACS Au : https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacsau.3c00564